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有哪些方法可以檢測(cè)遠(yuǎn)志皂苷元-過(guò)氧化物酶標(biāo)記物的活性?

2024-09-22 [64]

遠(yuǎn)志皂苷元-過(guò)氧化物酶標(biāo)記物|Senegenin-Peroxidase Conjugate(Senegenin-HRP)

以下是一些可以檢測(cè)遠(yuǎn)志皂苷元 - 過(guò)氧化物酶標(biāo)記物活性的方法:

 

比色法

原理:過(guò)氧化物酶在有過(guò)氧化氫存在的條件下,能使愈創(chuàng)木酚氧化生成茶褐色物質(zhì),該物質(zhì)在 470nm 處有最大吸收,通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)量 470nm 處的吸光度變化來(lái)測(cè)定過(guò)氧化物酶活性,進(jìn)而反映遠(yuǎn)志皂苷元 - 過(guò)氧化物酶標(biāo)記物的活性。

步驟:

制備反應(yīng)混合液:在 100mmol/L 磷酸緩沖液(pH 6.0 pH 7.050ml 燒杯中,加入愈創(chuàng)木酚 28μl,于磁力攪拌器上加熱攪拌直至愈創(chuàng)木酚溶解,待溶液冷卻后,加入 30% 過(guò)氧化氫 19μl,混合均勻,保存于冰箱中。

樣品處理:稱(chēng)取適量含有遠(yuǎn)志皂苷元 - 過(guò)氧化物酶標(biāo)記物的樣品,如組織樣品 1g,剪碎后放入研缽中,加適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿,以 4000r/min 離心 10 - 15min,上清液轉(zhuǎn)入 100ml 容量瓶中,殘?jiān)儆?5ml 磷酸緩沖液提取一次,上清液并入容量瓶中,定容至刻度,貯于低溫下備用1810。

比色測(cè)定:取光徑 1cm 比色杯 2 只,于 1 只中加入反應(yīng)混合液 3ml 和磷酸緩沖液 1ml,作為對(duì)照;另 1 只中加入反應(yīng)混合液 3ml 和上述酶液 1ml(如酶活性過(guò)高可稀釋之),立即開(kāi)啟秒表記錄時(shí)間,于分光光度計(jì)上測(cè)量波長(zhǎng) 470nm 下吸光度值,每隔 1min 讀數(shù)一次。

結(jié)果計(jì)算:以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小,即以 ΔA470/min?g(鮮重))表示之。也可以用每 min 內(nèi) A470 變化 0.01 1 個(gè)過(guò)氧化物酶活性單位(U)表示110

 

電化學(xué)測(cè)定法

原理:以過(guò)氧化氫、對(duì)苯二酚為酶的底物,測(cè)定加入過(guò)氧化氫后電流變化斜率與酶活之間的線(xiàn)性關(guān)系,從而快速、靈敏地測(cè)定總過(guò)氧化物酶的活性。

步驟:

準(zhǔn)備工作電極、參比電極和對(duì)電極,構(gòu)建電化學(xué)檢測(cè)體系。

配制含有過(guò)氧化氫和對(duì)苯二酚的底物溶液。

將含有遠(yuǎn)志皂苷元 - 過(guò)氧化物酶標(biāo)記物的樣品溶液加入到檢測(cè)體系中。

記錄加入過(guò)氧化氫后電流隨時(shí)間的變化,通過(guò)分析電流變化斜率與酶活性的關(guān)系來(lái)確定標(biāo)記物的活性。

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